RT–PCR 실험

RT–PCR을 이용하여 RNA isolation, B-actin PCR 등을 실험하고 band를 관찰하기 위해 실험을 진행하였습니다.

RNA 검출법으로는 RT-PCR법이 개발되기 이전부터 Northern blot analysis, dot blot analysis, nuclease protection method, insitu hybridization 법등을 이용하여 왔습니다. RT-PCR법은 미량 분자의 검출 감도면에서 Northern blot analysis, dot blot analysis, nuclease protection method 보다 우수하고, 조작이 빠르고, 간편하다는 점에서 보다 우수합니다. 특히 미량으로 존재하는 여러 종류의 시료를 동시에 해석하는 경우에 유용하므로 임상진단에도 폭넓게 응용되고 있습니다. 또한 RT-PCR법을 SSCP와 조합함으로써 mRNA의 미세한 구조이상을 고감도로 검출할 수 있어서 이 방향의 임상응용도 시험되고 있습니다 RT-PCR법은 RNA의 조제, 역전사효소 반응 (RT), PCR 등의 3단계로 나누어 집니다. 검출감도는 1 세포당 10 분자 정도이지만, 실제는 상기의 3단계에 대응하는 RNA의 회수율, RT반응의 효율, PCR의 효율, 그 중에서도 시료의 DNA 혼입에 의한 증폭반응의 저해 유무 등에 의해 최종 산물량이 정해집니다. 따라서 특히 미량의 RNA 분자를 검출하거나 정량 해석을 목적으로 할 때에는 각 단계에 있어 효율을 가능한 한 높이는 노력이 필요합니다.

일반적으로 RNA를 조제할 때에는 분해되지 않은 상태로 추출하기 위해서 추출 조작 과정에서 ribonuclease (RNase)의 혼입을 피하는 것이 필수 조건입니다. RNase는 극히 안정한 효소로 고온에서도 실활되지 않고, 보효소가 없거나 넓은 pH 영역에서도 활성을 유지하므로 혼입되지 않도록 충분한 주의를 기울여야 합니다. 외부로부터의 RNase 혼입을 막기 위해서는 가능한 한 멸균한 기구를 사용하여야 하고 Eppendofr tube나 pippette tip은 건열멸균한 것을 사용하여야 합니다. 또한 유리기구를 이용하는 경우는 0.1% diethylprocarbonate(DEPC) 용액을 처리하여 사용해야 하며, 조작중에는 고무장갑을 착용할 것 등의 주의가 필요합니다.

한편 RNase는 세포 내에도 존재합니다. RNA 추출 조작시 세포 구조를 파괴하면 세포 내 RNase가 RNA 분자와 접촉하여 이것을 분해합니다. 이 내인성 RNase의 활성을 제거하기 위해서는 단백질 제거 조작으로 RNase 자체를 제거하거나 RNase의 활성을 저해하여야 합니다.

Acid,Guanidiu Thiocyanoate/Phenol/Chloroform 추출법 (AGPC법)은 1987년에 chomczynski와 Sacchi에 의해 개발된 방법으로 고순도의 완전한 RNA를 비교적 단시간에 얻을 수 있습니다. 이 방법은 동물배양세포나 동물조직 등의 각종 재료에 응용할 수 있고, 또 비교적 소량의 재료에서도 RNA를 추출할 수 있어 가장 보편적으로 사용되고 있습니다. 미량 시료같은 경우는 Guanidium/Cesium Chloride (CsCl) 추출법을 이용하여 Rappolee가 보고한 방법으로 수천개 이하의 세포로도 RNA를 추출해 낼 수 있습니다. 이 때 미량의 RNA를 높은 효율로 침전하기 위해 적당량의 대장균 ribosomal RNA를 담체로 이용하는 것이 좋습니다.